Composta da tre nuclei fondamentali (l'Antico Fondo Estense, la Raccolta Campori e il Carteggio Muratoriano) conta più di 412.000 volumi e opuscoli, ha 1658 incunaboli, circa 16.000 Cinquecentine, preziosi codici miniati, molti dei quali esposti in mostra permanente, una preziosa raccolta di manoscritti musicali. I cimeli della Biblioteca, significativi della ricchezza della libreria ducale estense, sono la Bibbia di Borso d'Este, composta a Ferrara alla metà del XV secolo, preziosamente miniata nelle sue 1.200 pagine, il Messale di Borso, il Breviario di Ercole I d'Este, il De Sphaera, le Petites priéres de Reneé de France, il Mappamondo catalano e la Carta del Cantino composta tra il 1498 e il 1502, sulla quale sono già raffigurate le coste dell'America.