Formée de trois noyaux fondamentaux (l'ancien Fondo Estense, la Raccolta Campori et le Carteggio Muratoriano), elle compte plus de 412.000 volumes et opuscules, 1658 incunables, quelque 16.000 manuscrits, de précieux livres enluminés, pour la plupart constamment exposés, une collection rare de manuscrits musicaux. Les trésors de la Bibliothèque, signe de la richesse de la bibliothèque ducale, sont la Bible de Borso d'Este, réalisée à Ferrare à la moitié du XVe siècle, avec ses 1200 pages enluminées, le Missel de Borso, le Bréviaire d'Ercole I d'Este, le De Sphaera, les Petites prières de Renée de France, la Mappemonde catalane et la Carte de Cantino, composée entre 1498 et 1502, sur laquelle sont représentées les côtes de l'Amérique